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生物質譜(MALDI-TOF MS)--預防公共衛生事件的有力武器
2020-03-10


1

時光如水,靜默不言。

今年的二月顯得格外漫長,然三月已悄然開始。走在廣州的小街上,又見木棉花開,是那么的美。


看著一個個行人帶著口罩,護目鏡,有的甚至穿上了“雨衣”防護服,經過醫護人員以及全國人民的共同努力,3月8日0-24時全國新增確診已經降低至40例;截至3月7日12時, 國外累計確診達21302例。


目前中國的疫情控制已初見成效…但外國形勢仍不容樂觀…

新冠疫情屬于公共衛生突發事件,回顧歷史,這類事件時有發生。

01
2008年10月

由霍亂弧菌所致的烈性腸道傳染病,在海南大學發生,導致腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐及發熱等臨床癥狀,隨后海南省先后發生了幾起霍亂疫情,特別是2008年10月至11月,海南各市縣就確診霍亂33例,疑似病例和其他腸道傳染病超過300例

02
2012年7月

新疆澤普縣一起傷寒沙門氏菌引起的食物中毒,導致199人中毒,出現發熱惡心嘔吐腹瀉等臨床表現

03
2018年8月

由炭疽桿菌所致的一種人畜共患的急性傳染病在黑龍江發生,導致炭疽14例

04
2019年4月

蒙古爆發了由鼠疫桿菌所致的烈性傳染病鼠疫,導致2人死亡,169人隔離

......

這些烈性傳染病,對人類健康一直是個威脅,面對這些傳染病,我們更應該多做的是預防,盡早發現病菌,盡早遏止病菌的傳播。



2


隨著生物技術的發展,生物質譜的出現大大改變了微生物鑒定的現狀。尤其是對炭疽芽孢桿菌、鼠疫菌、霍亂弧菌、傷寒沙門菌、土拉弗朗西斯菌、O157大腸桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、類鼻疽伯克氏菌等具有嚴重傳染性強的致病菌的鑒別。


在生物質譜未應用之前,我們通過生化反應進行微生物鑒定,從純手工生化反應到自動化判讀,再到全自動孵育和判讀,鑒定時間從18-24小時縮減到4-8小時,操作實現自動化。生物質譜的出現,實現了鑒定時間從小時變成分鐘,并且操作更快捷簡便,更適合應對突發事件危害菌種的確認。





(生物質譜鑒定VS生化鑒定)



3

生物質譜

發展歷史


生物質譜(MALDI-TOF-MS)的發展源于軟電離技術MALDI與飛行時間質譜的完美結合。

基質輔助激光解吸電離(MALDI)的發展與ESI幾乎在同時期,MALDI是當時的質譜學家們極力尋找適合生物分子的離子化方法,它的起源可追溯到20世紀80年代,1985年德國科學家Micheal Karas與Franz Hillenkamp首次提出以有機小分子為基質增加生物小分子與激光解析法的離子化效率,1987年日本的田中耕一以鈷納米粒子與甘油混合物作為液態基質,并以337nm波長的脈沖激光輻照產生蛋白質分子,該技術被稱為軟激光解析,田中耕一的工作啟發了Micheal Karas與Franz Hillenkamp,Micheal Karas與Franz Hillenkamp通過進一步改良此方法使其成為質譜工作者所熟悉的MALDI。


由于田中耕一對早期研究激光解析在蛋白質電離中的應用上的啟發,2002年,田中耕一與另一“軟電離”技術電噴霧電離(ESI)同時獲得諾貝爾化學獎,這給予了這兩項技術極大的肯定。


飛行時間(TOF)質量分析器是一種利用靜電場加速后以離子飛行速度差異來分析離子質荷比的儀器,該儀器構想最早于1946年的W.E.Stephens提出,1955年出現第一臺商用飛行時間質譜儀。而具有脈沖特性的激光解析電離技術的出現,與脈沖高壓推動離子的飛行時間質譜的搭配非常適合。

MALDI的發展,如今已經35年,從那時起,通過應用這一“軟電離”技術與飛行時間質譜(MALDI -TOF MS)的結合,成功地實現了為生物大分子提供快速和高度可靠檢測手段的目的,同時也為生命科學領域提供了全新的分析方法。


(MALDI-TOF-MS)作為一種快速、可靠的微生物鑒定方法現如今已得到了廣泛的應用。盡管MALDI-TOF質譜儀的分辨率相對較低(full width at half maximum, FWHM: < 5,000),且與串聯質譜分析不兼容,但它已得到廣泛應用。相比其他質譜技術,MALDI-TOF操作簡便,不需要接受分析化學培訓的專業人員就可以使用。特別是近年來在基因分型分析、生物標志物鑒定、病原體鑒定、質譜成像等應用的發展,越來越被臨床等檢測領域所青睞。

目前該技術已成為中國國家標準GB/T33682-2017質譜鑒定微生物技術國家標準檢測方法。



4


生物質譜的
獨特性


蛋白質約占細菌干重的50%,其表達由遺傳性狀決定,受外界環境影響較小,具有多樣性、豐富性、易于提取和分離且不需要擴增的特點,因此成為目前MALDI-TOF MS技術檢測病原菌的最主要生物標志。

與有機質譜不同的是,生物質譜采用的是MALDI-TOF-MS,該技術可用于蛋白質、核酸、多糖等多種生物分子的測定,其基本原理為:在MALDI離子源部分,基質與樣本形成共晶體后,從激光中吸收能量使樣本解吸,基質與樣本間發生電荷轉移使得樣本分子電離;在TOF MS分析器部分,離子在電場作用下加速飛過飛行管道,飛行時間與離子的質荷比成正比,根據到達檢測器的飛行時間可測出質荷比,通過軟件處理就能得到病原菌特征性的指紋圖譜。通過分析檢測樣本菌株蛋白組成成分獲得特征性的模式峰,與數據庫中細菌指紋圖譜進行比較,從而鑒定細菌至屬、種,乃至亞種的水平。





(生物質譜原理圖)


隨著質譜微生物鑒定技術的發展,鑒定準確性更多的是與區分相似遺傳背景能力,提高置信度有直接的關聯,為了進一步提升質譜鑒定的準確性,目前主要手段是提升數據庫質量和優化分析方法。


因此,參考數據庫和數據分析方法成為微生物鑒定系統的關鍵組成部分。菌庫模型的建立對鑒定準確性影響較大,美國FDA對建庫菌株數量的建議是可鑒定菌種至少需要大于5株才可確保鑒定準確性,因此每種菌的建立過程采用不同來源的菌株,更能代表每種菌的實際蛋白圖譜。


另一方面是每種菌的蛋白圖譜采用權重算法把微小的蛋白表達差異都按照權重計算入內,這對于種間差異小的難鑒別的細菌間的鑒別尤為重要。


生物質譜的
快速便捷性


“便捷、快速、準確”是生物質譜鑒別微生物與傳統生化方式鑒別微生物最大的差別。

生物質譜操作簡便,不需要接受分析化學培訓的專業人員就可以使用。只需三步驟(通用方法)就能獲取鑒定結果:


第一步:實驗材料準備





(靶板:每個靶板有48個點位,16個點位為一組,可分3次使用;每組中心的小點位只用于涂校準菌株大腸埃希菌ATCC 8739







(試劑:
CHCA基質)

  (試劑:
甲酸)




其他材料:校準菌株(大腸埃希菌ATCC8739)、1μL塑料接種環(用于取菌和涂靶板)、加樣器(可調范圍0.5 –2.5μL)及加樣頭、質控菌株(產氣腸桿菌ATCC 13048、光滑假絲酵母ATCC MYA-2950


第二步:涂菌

涂菌和加基質是關鍵步驟,建議涂菌后立刻加基質,便于基質穿透細菌涂層


第三步:上機檢測





每個樣本只需1-2分鐘完成,鑒定準確性高達97.29%(FDA最新更新數據顯示




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